香菇富含多种营养(包括维生素、外部蛋白质、环境脂肪酸、条件体产氨基酸、对香的影矿物质元素),菇原同时具有宜人的生质生率香气,食之味道鲜嫩,量再口感绝佳,外部食用价值较高。环境香菇又被称为冬菇或香蕈,条件体产在分类学中属于担子菌纲,对香的影伞菌目,菇原口蘑科,生质生率香菇属,量再是外部一种为人们所喜爱的常见食用菌。中国是香菇消费和生产的大国,并且中国的香菇栽培规模也位列于世界的前端,然而在香菇的育种研究方面却有些许落后。所以,当务之急是香菇新品种研发以及原有品种的改良工作。
目前较为常用的育种手段是原生质体技术,这一技术能够在一定程度上有效缩短食用菌的育种周期,但是,此项技术还未在全国范围内进行推广实施,目前由原生质体技术所派生出的育种技术主要有以下4类,原生质体诱变、原生质体转化、原生质体融合、原生质体单核化。相对于其他育种方式而言,原生质体育种具有育种周期短、效率高的特点,同时对于食用菌的品质、产量以及抗性都有显著的提升效果,进而提高香菇的育种水平。这个过程里面原生质体育种的基础是原生质体的制备和再生。所以,本文重点研究外部环境条件对于香菇原生质体产量与再生率的影响,以此作为食用菌类的原生质体育种工作的参照。
1 材料与方法
1.1 供试材料
供试食用菌种:香菇(Letinula Edodes)辽抚4号编号0912,由抚顺市农业科学研究院提供;母种培养基(克/升):马铃薯200.0、蔗糖10.0、葡萄糖10.0、蛋白胨2.0、木屑150.0(煎汁过滤)、硫酸0.5、磷酸二氢钾1.0、水1000.0、琼脂粉12.0,培养基的酸碱度调整至5.5;再生培养基:与母种相同,外加稳渗剂进行定容。
稳渗剂配置:甘露醇、0.4摩尔/升的硫酸镁、氯化钠、氯化钾,pH=5的蔗糖和葡萄糖液体。其他试验试剂:0.22微米微孔滤膜过滤除菌,该试剂需要现配现用,酶液用对应稳渗剂配制酶浓度(W/V,重量体积比)1.0%的蜗牛酶,纤维素酶与混合酶(蜗牛酶∶纤维素酶=1∶1)。Cellulase(MP Biomedical)及Snailase(Wolsen)等为国产分析纯。
1.2 试验方法
原生质体数量统计:利用血球板进行计数,首先将原生质体稀释至108,涂至平板上,然后按照公式:原生质体产量(个/毫升)=每格平均原生质体数×400×稀释倍数×104进行计算。原生质体再生率(%)=[(再生平板菌落数-CK板菌落数)×稀释倍数]/(涂布体积×原生质体浓度)×100方案设计:选取7个外部环境因素,考察这7个外部环境因素对香菇原生质体的产量以及再生率的具体影响。详情见表1。
2 结果与分析
2.1 不同种类裂解酶原生
质体产量与再生率的影响如图1所示,混合酶的酶解效果要比单一酶所产生的酶解效果好一些,混合酶作为酶解介质时,单位时间内原生质体的产量最高能达5.69×108个/毫升,此产量是蜗牛酶作为酶解介质原生质体产量的1.42倍,是纤维素酶作为酶解介质产量的4.15倍;混合酶作为酶解介质时,原生质体再生率是0.91%,蜗牛酶作为酶解介质的原生质体再生率为0.9%,达到了纤维素酶作为酶解介质时原生质体再生率的2.39倍。产生如此大差异的原因是,香菇自身的菌丝细胞壁组成成分比较复杂,因此,需要不同种类的酶共同作用,才能对其产生较好的降解作用。在此组试验中,蜗牛酶是包含了淀粉酶、蛋白酶等20多种不同种类的酶于一体。因此,其酶解效果与混合酶一样能够较好的刺激原生质体的再生,但是纤维素酶成分比较单一,故而对原生质体的酶解效果一般。综上研究,在后续的多因素试验中会优先选择混合酶作为介质。
2.2 酶解时间对原生质体产量与再生率的影响
通过图2可以看出,酶解时间在3小时之内时,原生质体再生率与时间呈正相关的关系,随着时间的增加,原生质体的产量也不断增加。之后,原生质体的再生率则会出现下降。在整个酶解过程中原生质体产量从2小时后明显上升,2.5小时后逐渐下降。回归分后,可知酶解时间为2.82小时,原生质体再生率达到顶点1.7%;酶解时间为3.44小时,原生质体产量达到最高2.27×108个/毫升。
2.3 酶解温度对原生质体产量与再生率的影响
原生质体的产量及再生率受温度影响效果明显,其中30℃是原生质体产量变化的临界点,在这之前原生质体产量醉着温度升高而增加,之后则出现明显的下降。经过回归方程计算可以得出,原生质体再生率在30℃达到最高,为1.08%,原生质体产量在29℃达到最高,为4.06×108个/毫升。分析其他酶解介质可以得出,蜗牛酶的最适酶解温度范围是30~37℃,纤维酶的最适酶解温度为35℃左右,当温度处于最适酶解温度时,其对于菌丝体细胞壁的酶解效果最好。因此,菌丝的细胞壁分解效率较高。而对于混合酶来说,虽然在35℃时酶活性较高,但是较高的温度会扰乱菌丝的内部代谢,影响细胞体内部稳定性,最终影响原生质体的产生。因此,当温度高于30℃,原生质体的再生率和产量均出现了明显下降。
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