天然的产共CLA主要存在于动物、植物、轭亚海产品中,油酸如在牛、菌株酵性究羊等反刍类动物的选及乳脂和肉制品中含量较高。c9,质研t11-CLA还被命名为瘤胃酸(ru-menicacid)。产共自上世纪50年代开始,轭亚人们接连在反刍动物的油酸脂肪组织、烤牛肉中发现了CLA,菌株酵性究并证实其抗癌功能。选及发酵乳是质研经乳酸菌发酵动物乳而制成的,因独特的产共滋味和特殊的营养价值而受到人们的喜爱。对发酵乳产品的轭亚检测,包括感官评价、油酸理化指标、污染物限量、真菌毒素限量、微生物限量、乳酸菌数等。对发酵乳发酵性能的检测包括质构、流变、滋味、气味、持水性等指标。
目前,在原始发酵乳基础上加入其它营养物质,以提高发酵乳的营养特性、风味特性和发酵特性的产品越来越多。加入益生菌的发酵乳营养更加丰富,摄入的益生菌在人体内积累定植后,对改善宿主体内的微生态平衡具有重要作用,益生菌乳制品同时还具有缓解乳糖不耐症,抗高血压,降低生殖道感染风险,促进Ca2+吸收和维生素生成等功能。许多可生产CLA的菌株均为乳酸菌,可用于发酵。当使用能生产CLA的菌株生产功能性乳制品时,便可将CLA较好地融入产品中,从而利于乳制品的多种有益功能。有研究发现,将产CLA的乳酸乳球菌、植物乳杆菌和干酪乳杆菌复配后发酵牛奶,所得产物中CLA最大值为56.51mg/mL。目前大多CLA在食品中应用较少,如何能获得高产CLA的乳酸菌并应用于发酵乳中,具有较大的意义。本研究从发酵乳中筛选菌株,得到产共轭亚油酸的菌株,将其直接用于制作发酵乳,研究该菌株的发酵性能,测定CLA的产量,评估发酵乳的综合指标,以获得CLA含量高,品质好的发酵乳。
发酵乳样品和纯牛奶采自内蒙古呼和浩特和呼伦贝尔,采集后置于无菌容器,放于冰盒中带回。革兰氏染色液试剂盒,索莱宝科技有限公司(北京);细菌DNA提取试剂盒,康为世纪生物科技有限公司(北京);DL2000DNAMarker、DL15000DNAMarker,大连宝生物;2×EsTaqMasterMix(Dye)、6×SuperStainLoadingBuffer,北京康为世纪;溶菌酶,北京索莱宝;琼脂糖,北京中科瑞泰生物;亚油酸(LA),90%纯度,上海联迈生物;共轭亚油酸标准品(CLA),Sigma公司。
PCR仪(Eppendorf)、高速冷冻离心机(Ep-pendorf),德国Eppendorf公司;超微量核酸蛋白定量仪(ThermoFisher),ThermoFisher公司;质构仪(BROOKFIELD),美国BROOKFIELD;电子舌(In-sent),日本Insent。
发酵乳梯度稀释后涂布MRS平板,37℃培养2d。挑取菌落状态不同的透明和半透明单菌落,每个单菌落经过3~4次划线纯化后,37℃,静置培养24~48h,保存备用。
挑取待检菌落于载玻片,滴入生理盐水稀释,固定后进行染色,具体操作见革兰氏染色液试剂盒说明书,染色后于显微镜下观察菌体形态。
选取CLA质量浓度为0.0,2.5,5.0,7.5,10.0,12.5,15.0μg/mL的样品,测定吸光度值(λ=233nm),制作标准曲线。选取革兰氏染色阳性菌株接种MRS培养基(0.5mg/mLLA),37℃培养24~48h,加入正己烷充分振荡,4℃,10000g离心10min,取上清液测定吸光度值(λ=233nm),根据标准曲线计算生成CLA的含量。
利用细菌基因组DNA提取试剂盒提取已筛选的乳酸菌基因组,稀释基因组DNA至终质量浓度为20ng/μL,以此为模板,用16s通用引物进行PCR扩增,PCR验证结果呈阳性的菌株送交上海派森诺生物科技股份有限公司测序。
以发酵乳的质构特性、滋味特性和CLA产量作为考察指标,研究植物乳杆菌HAC01接种量、发酵温度、发酵时间、发酵pH值、LA添加量,发酵结束后后熟时间对发酵性质的影响。利用质构仪测定硬度、稠度、黏度、黏聚性等指标,测定条件及参数为:探针选择直径为2.5cm的平底圆柱形探针,测定模式选择阻力测试,感应力选择自动感应10g,测定前下降速度1.0mm/s,测定速率2.0mm/s,测定后速度8mm/s,进入样品深度20mm,对测试样品进行两次压缩,间隔时间5s。利用电子舌测定样品的综合味觉信息,指标包括酸、甜、苦、咸、鲜。
使用DPS数据处理系统V7.05进行均匀设计和数据分析,优化反应条件。
为得到具有较高CLA产量的菌株,本试验从采集的发酵乳样品分离纯化菌种,利用菌落形态和革兰氏染色进行初步鉴定,结果如表1所示,乳酸菌菌落形态基本呈半透明、圆形隆起状,革兰氏染色为阳性。
测定筛选出的25株革兰氏阳性菌的CLA产量,结果见图1所示,其中产量最高的为7号菌株,CLA产量为(2.7197±0.0056)μg/mL,选取产量相对高的10株菌进行后续试验;CLA标准曲线如图2所示,由标准曲线得到回归方程:Y=0.0741X+0.0032,线性相关系数R2=0.9991。
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